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原位分子雜交技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。
實(shí)驗(yàn)方法及步驟
1.  探針變性
將探針在75℃恒溫水浴中溫育5 min，立即置0℃，5～10 min，使雙鏈DNA探針變性。
2.  標(biāo)本變性
（1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3 h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。 
（2）取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70% 甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3 min。 
（3）立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5 min，然后空氣干燥。
3.  雜交
將已變性或預(yù)退火的DNA探針10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交（約15～17 h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。
4.  洗脫
此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。
（1） 雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。 
（2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5 min。 
（3） 在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5 min。 
（4） 在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗一下。 
（5） 取出玻片，自然干燥。 
（6） 取200 μL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
5.  雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）
（1） 在玻片的雜交部位加150 μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。 
（2） 去掉保鮮膜，再加150 μL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40 min。 
（3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5 min。 
（4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加150 μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20 min。
（5） 去掉保鮮膜，加150 μL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40 min。 
（6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5 min。 
（7） 重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。 
（8） 取出玻片，自然干燥。 
（9） 取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
雜交：
     1）準(zhǔn)備探針；
     2）取一個(gè)較大的濕盒，交叉放置切片；
     3）滴10μl探針在切片的組織上，加蓋玻片；
     4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12h～16h。
     雜交后的水洗：
     5）鑷子小心去除蓋玻片；
     6）43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
     7）2×SSC(37℃)洗兩次，每次10min；
     8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測(cè)，勿使切片干燥。
     檢測(cè)：
     9）從1×PBS中取出切片，除去過(guò)多的水分，避免標(biāo)本干燥。把切片放入濕盒內(nèi)，同時(shí)處理4張切片。
     10）每張切片使用30μl～60μl羅丹明抗或FITC卵白素，室溫下孵育20min；
     11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
擴(kuò)增：
     12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
     13）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
     14）去掉塑料蓋膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min；
     15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
     16）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
     17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。